Limfotsitlarni ajratish vositasi (kalamush, sichqoncha)

Ushbu mahsulot kalamush va sichqonlarning periferik qon limfotsitlarini ajratish uchun mos bo'lgan gradient zichligi ajratish eritmasidir. Uning printsipi asosan turli periferik qon hujayralari orasidagi zichlik farqiga asoslanadi (qizil qon tanachalari va granulotsitlarning zichligi taxminan 1.090 g/ml; trombotsitlar 1.030-1,035 g/ mL limfotsitlar va monositlar 1.075-1.090 g/mL) va periferik qondan gradient bilan ajralib turadi; zichlik santrifugasi. Ushbu mahsulot steril, past endotoksin darajasiga ega, zichligi 1,083 ± 0,001 g/ml (20 daraja) bo'lgan foydalanishga tayyor ajratuvchi eritmadir. Kemiruvchilar limfotsitlarining zichligi odam limfotsitlariga qaraganda bir oz yuqoriroq, periferik qonni sichqonlardan ajratib olish gemolizga moyil. Ushbu xususiyatlarga asoslanib, mahsulot an'anaviy Ficoll-meglumine asosida qon qo'shilgandan keyin uzoqroq vaqt davomida ajratish eritmasining barqarorligini saqlab qolish uchun optimallashtirilgan va operatsiya oddiy va izolyatsiya qilingan limfotsitlar yuqori tozalik va yaxshi holatda.

Ho'l muz bilan kema; Qorong'i joyda 2-8 darajada saqlang, 12 oy davomida amal qiladi.

Sichqonchaning periferik qonidan 1 ml limfotsitlarni ajratish uchun qonning limfotsitlarni ajratish muhitiga hajm nisbati 1:1-1:2 ni tashkil qiladi, bu diapazonda tegishli tuzatishlar kiritiladi; Santrifüj naychasini tanlashda qon va limfotsitlarni ajratish muhitining umumiy hajmi kolba hajmining uchdan ikki qismidan oshmasligiga e'tibor berish kerak.

1. 1 ml yangi antikoagulyant butun qonni oling (geparin, EDTA, natriy sitrat va boshqa antikoagulyantlar ishlatilishi mumkin), teng miqdorda PBS (G4202 tavsiya etiladi) yoki Hanks buferi (tavsiya etilgan g4203) bilan suyultiriladi, unda kaltsiy va magniy mavjud emas. 2 ml suyultirilgan to'liq qon.

2. Sichqon va kalamushlardan olingan 3 ml periferik qon limfotsitlarini ajratib olish uchun eritmani 15 ml steril santrifüj trubkasiga pipetka bilan soling (EP{3}}J tavsiya etiladi).

3. Santrifüj trubkasini 45 gradusga egib, asta-sekin 2 ml suyultirilgan qonni naycha devori bo'ylab santrifuga trubasiga qo'shing, shunda qon kalamush va sichqonlarning periferik qon limfotsitlarini ajratish muhitining yuqori qatlamida tekis yotadi.

4. Gorizontal bosh santrifugadan foydalanish, trubkani gorizontal boshli adapterga joylashtirish, sentrifuga tezligini kamaytirish (3-5 tezliklar mos keladi) va xona haroratida 25 minut davomida 800 xg sentrifuga qilish tavsiya etiladi.

5. Santrifüjdan so'ng, trubka naychali stendda yumshoq tutiladi va aniq tabaqalanish kuzatiladi: eng yuqori qatlam plazma qatlami; yuqori o'rta qavat - limfotsitlar qatlami; pastki o'rta qatlam - limfotsitlarni ajratish muhiti; eng pastki qavat esa eritrotsitlar va granulotsitlar qatlamidir (ilova qilingan rasmga qarang).

6. Eng yuqori plazma qatlamini olib tashlang va tunika albuginea qatlamini (limfotsit qatlami) yangi steril santrifüj naychasiga ehtiyotkorlik bilan aspiratsiya qiling.

7. 8 ml PBS (tavsiya etilgan G4202) yoki boshqa bufer bilan yuving, 100 xg da 10 daqiqa davomida santrifüj qiling, so'ngra supernatantni tashlang.

8. 7-bosqichni takrorlang (ixtiyoriy).

9. Tajriba maqsadiga muvofiq limfotsitlarni kerakli muhitda yoki buferda resuspenziya qilish.

1. Mahsulotni ishlatishdan oldin xona haroratida to'liq muvozanatlash va teskari aralashtirish kerak. Ajratish uchun mos harorat 18-25 daraja.

2. Limfotsitlar faolligini saqlab qolish uchun qon to'planganidan keyin 2 soat ichida yangi antikoagulyatsion qonni tanlash yaxshidir; Agar izolyatsiya qilingan limfotsitlarni qo'shimcha ekish va tekshirish kerak bo'lsa, iltimos, qon to'plash va ajratish paytida aseptik operatsiyaga e'tibor bering.

3. Buferni suyultirish yoki yuvish, qon hujayralarining to'planishiga yo'l qo'ymaslik uchun kaltsiy va magniy ionlarini o'z ichiga olgan tamponni ishlatmang.

4. Limfotsitlarning tunica albuginea qatlamidan tashqarida tarkibiy qismlarning haddan tashqari so'rilishi birlashma joyidagi ba'zi granulotsitlar yoki trombotsitlarning aralashishiga olib keladi.

5. Qon namunalari orasidagi farqlar ajratish natijalariga ta'sir qilishi mumkin. Santrifüj kuchi va vaqtni haqiqiy vaziyatga qarab mos ravishda sozlash mumkin. Malumot markazdan qochma kuchi va vaqt oralig'i 500-1000 g va 20-30 min.

6. Qon va limfotsitlarni ajratish muhitini ma'lum vaqt aralashtirgandan so'ng qizil qon hujayralarining joylashishi normaldir.

7. Xavfsizligingiz va sog'ligingiz uchun himoya ko'zoynak, qo'lqop yoki himoya kiyim kiying.

Qo'shimcha: ajratishdan oldin va keyin har bir qatlamning sxematik diagrammasi

Ushbu mahsulot faqat ilmiy tadqiqot maqsadlari uchun mo'ljallangan, klinik tashxis uchun emas!