Click-iT Edu-555 Hujayra proliferatsiyasini tahlil qilish to‘plami

 

mahsulot nomi	Mahsulotni identifikatsiya qilish	model
Click-iT Edu-555 Hujayra proliferatsiyasini tahlil qilish to‘plami	G1602	100T

 

 

Hujayra ko'payish qobiliyatini tahlil qilish hayot haqidagi fanlarda keng tarqalgan va muhim baholash usuli hisoblanadi. U ma'lum genlar, dorilar va boshqalarning in vitro ekilgan hujayralarga ta'sirini baholashi yoki turli sharoitlarda yoki stimulyatsiya ostida to'qima hujayralarining o'sishi va yangilanish qobiliyatini tahlil qilishi mumkin. Hozirgi vaqtda hujayra proliferatsiyasini aniqlashning ko'plab usullari mavjud. Ularning aksariyati hujayra proliferatsiyasi faolligini bilvosita baholash uchun hujayralar tomonidan ishlab chiqarilgan ba'zi metabolik fermentlardan foydalanadi (masalan, CCK-8 usuli, MTT usuli va boshqalar), lekin ba'zi dorilar yoki hujayraning o'zi holatiga ma'lum ta'sir ko'rsatadi. baholash natijalari. Hujayra proliferatsiyasini aniqlash uchun hujayralardagi DNK sintezini bevosita aniqlash eng aniq va samarali aniqlash usuli sifatida tan olingan. Shu bilan birga, radio-yorliqli nukleozidlarni kiritishning asl usuli ham, antikorlarni aniqlashga asoslangan BrdU usulini keyingi takomillashtirish ham o'z cheklovlariga ega.

EU (5-Etinil-2'-deoksiuridin, 5-etinil-2'-deoksiuridin) hayvonlarga yoki inkubatsiya qilingan hujayralarga yuborilganda asetilen guruhini o'z ichiga olgan timidin analogidir. vitro, bu kichik molekulalar tezda turli organlar va to'qimalarga tarqalib, hujayralarga singib ketishi va o'rnini bosishi mumkin. hujayra proliferatsiyasi jarayonida yangi sintez qilingan DNKga timidin (T). EU molekulasidagi asetilen guruhi mis ionlarining katalizi ostida barqaror triazol halqasini hosil qilish uchun floresan iF488 etiketli azid birikmasi probi bilan reaksiyaga kirishishi mumkin, shuning uchun yangi sintez qilingan DNK mos keladigan lyuminestsent zond bilan belgilanishi mumkin. Radioaktiv yorliqli nukleozidlarni kiritish usuli bilan solishtirganda, EU aniqlash usuli radioaktiv ifloslanish kabi cheklovchi omillarga ega emas; BrdU aniqlash usuli bilan solishtirganda, EdU aniqlash usuli DNK denatüratsiyasini yoki antigen-antikor reaktsiyasini talab qilmaydi, bu eksperimentning murakkabligini sezilarli darajada kamaytiradi, shuningdek, tajribani vaqtni tejaydigan, sezgirroq, barqarorroq va aniqroq qiladi.

Ushbu to'plam madaniyatli hujayralar yoki hayvonlarning to'qimalarida hujayra proliferatsiyasini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin. Ushbu to'plamdagi lyuminestsent probi qizil floresan, maksimal qo'zg'alish to'lqin uzunligi 557 nm va maksimal emissiya to'lqin uzunligi 570 nm. Ko'payadigan hujayralar etiketlangandan so'ng, hujayra yadrosi yorqin qizil floresansni ko'rsatadi va hujayra yadrosi mos keladigan an'anaviy yadro bo'yog'i bilan birgalikda etiketlanadi (Ushbu to'plam Hoechst 33342 hujayra yadro bo'yog'ini taqdim etadi), siz flüoresan mikroskop, lazerli konfokal mikroskopdan foydalanishingiz mumkin. va hujayra proliferatsiyasini bevosita kuzatish uchun boshqa asboblar; siz in vitroda ekilgan hujayralarning floresans intensivligini aniqlash uchun oqim sitometriyasidan foydalanishingiz mumkin, so'ngra S fazasining o'rtalarida floresans intensivligi DNK replikatsiyasi faolligiga asoslangan hujayra siklini aniqlashingiz mumkin.

 

 

Nam muz bilan tashish; EdU katalitik reaktivi (Reagent A) va reaksiya buferi 4 daraja haroratda saqlanishi mumkin, amal qilish muddati 12 oy.

 

 

Komponent raqami	Komponent	G1602-100T
G1602-1	EU saqlash yechimi (10 mM)	100 μL
G1602-2	Katalitik reagent (Reagent A)	120 μL
G1602-3	Floresan bo'yoq iF555 (reagent B)	50 μL
G1602-4	Katalitik qo'shimcha (Reagent C)	2×100 mg (chang)
G1602-5	Reaktsiya buferi	20 ml
G1602-6	Hoechst 33342 binoni eritmasi	30 μL
Qo'llanma		Bitta nusxa

 

 

1. Tarkibida sarum bo'lgan hujayra madaniyat muhiti;

2. O'tkazuvchanlik reagenti: 0.2%- 0.5% Triton® X-100 PBS (G1204);

3. Fiksativ: 4% paraformaldegid (G1101) yoki boshqa shunga o'xshash reagentlar;

4. Fosfat-buferli tuz (PBS);

5. O'ta toza suv;

6. Hayvonlarni modellashtirish va to‘qima bo‘limiga oid reagentlar (hayvon to‘qimalari hujayralarining ko‘payishini aniqlash)

 

 

1. Madaniyatli hujayralarni in vitroda oldindan davolash:

1.1. Hujayralarni hujayra madaniyati plastinkasiga ma'lum bir zichlikda bir tekisda ekish (ekish zichligi hujayra hajmi, o'sish tezligi va boshqalar kabi omillar bilan belgilanadi). Hujayralar devorga yopishganidan yoki normal holatga qaytgandan so'ng, tegishli dori stimulyatsiyasi va boshqa muolajalarni bajaring. (Suspenziya xujayralari uchun, iltimos, suspenziya hujayralarining normal ishlash usuliga rioya qiling. Butun tajribaga santrifüj va boshqa bosqichlarni qo'shish kerak).

1.2. Katalitik qo'shimcha (Reagent C) past tezlikda santrifüj qilindi, 100 mg olindi va 1 ml o'ta toza suv qo'shilishi bilan eritildi va tarqatildi va -20 darajada saqlanadi, qolgan kukun zaxira sifatida saqlanadi.

2. In vitro hujayrali EU yorlig'i, fiksatsiyasi va o'tkazuvchanligi:

2.1. 2×EdU inkubatsiya ishchi eritmasini tayyorlang: 20 mkM 2×EdU inkubatsiya ishchi eritmasi bo‘lgan har 1 ml to‘liq hujayra madaniyati muhitiga 2 mL Edu saqlash eritmasi (10 mM) qo‘shing va uni oldindan qizdirish uchun inkubatorga qo‘ying (tavsiya etiladi). EU ish konsentratsiyasi dastlabki tajribalar uchun 10 mkM);

2.2. Yarim o'zgaruvchan rejimda madaniyat plastinkasida asl hujayra madaniyat muhitining yarmini aspiratsiya qiling va teng hajmda oldindan qizdirilgan 2 × EdU inkubatsiya ishchi eritmasini qo'shing va ma'lum vaqt davomida inkubatsiya qiling (inkubatsiya davomiyligi odatda bog'liq). Odatda hujayra tsiklining taxminan 10% ni tashkil etadigan mos keladigan hujayralarning o'sish sikli bo'yicha 2 soat tavsiya etiladi, uni hujayra xususiyatlari, davolashdan keyingi haqiqiy holat va boshqalar bilan moslashtirish kerak. Agar uzoqroq inkubatsiya vaqti talab etilsa, EU ish konsentratsiyasini mos ravishda qisqartirish mumkin EU konsentratsiyasi mos ravishda oshirilishi mumkin);

2.3. EU inkubatsiyasidan so'ng, PBS buferi bilan 1-2 marta yuving, hujayralarni yopish uchun mahkamlash suyuqligi qo'shing va xona haroratida 15 daqiqa davomida mahkamlang (agar oqim sitometriyasi zarur bo'lsa, yopishgan hujayralar hazm bo'lishi va bu bosqichdan oldin qayta suspenziya qilinishi kerak. tuzatish, suspenziya xujayrasini qayta ishlash usuliga rioya qiling); PBS buferi bilan 2-3 marta yuving, har safar 3-5 daqiqa;

2.4. PBS buferini olib tashlang, hujayralarni qoplash uchun o'tkazuvchanlik eritmasini qo'shing va xona haroratida 15 daqiqa davomida inkubatsiya qiling;

2.5. O'tkazuvchanlik eritmasini olib tashlang, PBS buferi bilan 1-2 marta yuving, har safar 3-5 daqiqa. Keyin 4-bosqichga o'ting.

3. Hayvonlar uchun EU in'ektsiyasini modellashtirish, shuningdek to'qimalar bo'limini qayta ishlash:

3.1. Eksperimental talablarga ko'ra, bir yoki bir nechta EU in'ektsiyalari hayvonlarni qorin bo'shlig'iga, mushak ichiga, teri ostiga, quyruq tomirlariga in'ektsiya qilish orqali modellashtirish uchun ishlatiladi. Umuman olganda, EU dozasining hayvon tana vazniga nisbati 5 mg / kg ni tashkil qiladi, haqiqiy in'ektsiya dozasi tadqiqot mazmuniga va hayvonlarning sharoitlariga bog'liq. Ushbu to'plamda taqdim etilgan EU saqlash yechimi asosan in vitro hujayra EU yorlig'i uchun ishlatiladi. Agar siz hayvonni EdU bilan modellashtirishingiz kerak bo'lsa, siz EdU reaktiviga alohida buyurtma berishingiz mumkin (Mushuk №: G5059);

3.2. Ingichka ichak kabi epiteliya hujayralari tez, miya hujayralari esa sekin ko'payadi. Tezroq o'sadigan to'qimalarni etiketkalash uchun odatda 12 soatdan kamroq vaqt ketadi, sekinroq o'sadigan to'qimalar esa etiketkalash uchun bir necha kun vaqt olishi mumkin. Optimal yorliqlash vaqti maxsus tajriba asosida aniqlangan. Ichak epiteliya to'qimalarining tez tarqalishi tufayli bunday to'qimalar etiketka uchun mos yozuvlar sifatida tavsiya etilgan.

3.3. Hayvon belgilangan standartlarga muvofiq o'ldirilgandan so'ng, zarur bo'lgan to'qimalar olinadi va an'anaviy protseduralar bo'yicha muzlatilgan bo'laklar yoki kerosin bo'laklari tayyorlanadi:

a. Muzlatilgan bo'laklar uchun: bo'limlarni xona haroratiga qaytaring, tegishli miqdorda Fikslash suyuqligi qo'shing va xona haroratida 15 daqiqa davomida mahkamlang. Fikslashtiruvchi suyuqlikni olib tashlang va har biri 3-5 daqiqa davomida PBS buferi bilan 3 marta yuving; PBS buferini olib tashlang va to'qimalarni tegishli miqdorda o'tkazuvchanlik eritmasi bilan yoping va xona haroratida 10-15 daqiqa davomida inkubatsiya qiling; o'tkazuvchanlik eritmasini olib tashlang va PBS buferi bilan 1- 2 marta, har safar 3-5 daqiqa yuving. Keyin 4-bosqichga o'ting.

b. Parafinli bo'laklar uchun: bo'limlarni parafinsizlang va regidratlang, 5 daqiqa davomida PBS bilan yuving. PBS buferini olib tashlang, hujayralar yoki to'qimalarni qoplash uchun o'tkazuvchanlik eritmasini qo'shing va xona haroratida 15 daqiqa davomida inkübe qiling; Keyin PBS buferi bilan 1-2 marta, har safar 3-5 daqiqa yuving. Keyin 4-bosqichga o'ting.

4. EDU bosish reaktsiyasi:

4.1. Hujayra yoki to'qimalarni mahkamlash va teshilish jarayonida reaksiya eritmasini tayyorlash: reagentlarni quyidagi nisbatga muvofiq aralashtiring, preparat hajmini namunalar soniga mutanosib ravishda oshirish yoki kamaytirish mumkin.

 

Komponent	Ovoz (hujayra uchun)	Hajmi (gistologik bo'lim uchun)
reaksiya buferi	935 μL	928 μL
Reaktiv A	10 μL	10 μL
Reaktiv B (iF555 bo'yoq)	5 μL	12 μL
Reaktiv C	50 μL	50 μL
umumiy quvvat	1000 μL	1000 μL

 

4.2. PBS buferini hujayralar yoki bo'limlardan olib tashlang, reaktsiya eritmasini qo'shing, reaktsiya eritmasi barcha hujayralar yoki to'qimalarni qamrab olishini ta'minlash uchun sekin silkiting va qorong'i joyda xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling;

4.3. Reaktsiya eritmasini olib tashlang, PBS buferi bilan 2-3 marta yuving, har safar 3-5 daqiqa (Agar boshqa maxsus talab bo'lmasa, floresans intensivligini oqim sitometriyasi orqali aniqlash mumkin yoki floresans effektini aniqlash mumkin). boshqa asboblar).

5. Yadroviy dog ​​'(ixtiyoriy):

5.1. Hoechst 33342 binoni eritmasini PBS buferi bilan 1:500-1000 nisbatda suyultiring, hujayralarni yopish uchun namunaga qo'shing va 5 daqiqa davomida inkubatsiya qiling;

5.2. Hoechst 33342 binoni eritmasini olib tashlang, PBS buferi bilan 2-3 marta yuving, har safar 3-5 daqiqa.

6. Rasmga tushirish va aniqlash tahlili:

Qayta ishlangan hujayralar yoki to'qima bo'limi namunalarini aniqlash uchun floresan mikroskop yoki konfokal mikroskopdan foydalaning va ko'payadigan hujayralar nisbatini tahlil qiling. Shu bilan bir qatorda, in vitro ekilgan hujayralarni yig'ish va floresans intensivligini oqim sitometriyasi yordamida o'lchash mumkin (oqim sitometriyasi tahlili uchun salbiy nazorat sifatida EdU bilan belgilanmagan hujayra namunalaridan foydalanish va tegishli kuchlanishni tanlash tavsiya etiladi) va floresan intensivligi bo'yicha hujayra siklidagi S-fazasining DNK replikatsiya faolligini aniqlash mumkin. Ushbu to'plamdagi lyuminestsent bo'yoq if555 (Reagent B) Ex/Em spektral xarakteristikasiga mos keladi: 557 nm/570 nm (qizil); Hoechst 33342 binoni eritmasi Ex/Em spektral xarakteristikasiga mos keladi: 346 nm/460 nm (ko'k).

 

 

1. Madaniy hujayralar uchun maxsus EU konsentratsiyasi va inkubatsiya vaqti namuna va tadqiqot maqsadiga qarab mos ravishda sozlanishi mumkin.

2. Ba'zi to'qimalar hujayralari sekin ko'payadi. Modellashtirishning yomon ta'siriga yo'l qo'ymaslik uchun tez ko'payadigan to'qimalar namunalarini mos yozuvlar namunalari (masalan, ichak to'qimalari) sifatida tanlash tavsiya etiladi.

3. Agar fon rangi juda qorong'i bo'lsa, bu eksperimentda etarli darajada yuvilmaganligi, uzoq vaqt fiksatsiyalangan va qoldiq fiksator va boshqalar tufayli yuzaga kelishi mumkin.

4. Reaktiv C (EdU katalitik qo'shilish reagenti) oson oksidlanadi. Havoga uzoq vaqt ta'sir qilmaslikka harakat qiling. Suvli eritma sifatida tayyorlangandan so'ng, uni alikotda saqlash tavsiya etiladi; Sinovdan o'tgan, masalan, EdU katalitik qo'shimcha reagent rangi biroz o'zgargan bo'lsa, katalitik tizimni bosish reaktsiyasi hali ham normal ishlay oladi. agar C reaktivi jigarrang bo'lsa, bu komponentning amal qilish muddati tugaganligini bildiradi, shuning uchun uni tashlang.

5. Sog'ligingiz va xavfsizligingiz uchun, iltimos, ish paytida laboratoriya xalati va qo'lqop kiying.

 

Faqat tadqiqot uchun foydalanish uchun!

 

 

Issiq teglar: click-it edu-555 hujayra proliferatsiyasini tahlil qilish to'plami, Xitoy click-it edu-555 hujayra proliferatsiyasini tahlil qilish to'plami ishlab chiqaruvchilar, yetkazib beruvchilar, zavod