Click-iT 647 Tunel Cell Apoptosis Detection Kit

 

Mahsulot nomi	Mushuk. Yo'q.	Spesifik.
Click-iT 647 Tunel Cell Apoptosis Detection Kit	G1509-50T	50T

 

 

Apoptozda xromosoma DNKsining parchalanishi bosqichma-bosqich, bosqichma-bosqich jarayondir. Xromosoma DNKsi avval endogen nuklein kislota gidrolazalari ta’sirida katta 50-300 kb segmentlarga parchalanadi, so‘ngra xromosoma DNKsining taxminan 30% Ca2+ va Mg{{3} ishtirokida nukleosoma birliklari orasidan tasodifiy kesiladi. } qaram nuklein kislota endonukleazlari 180-200 bp nukleosoma DNK multimerlarini hosil qiladi. Shunday qilib, kech apoptozda DNK 180-200 bp bo'laklarga parchalanadi va singan genomik DNKda ko'p sonli 3'-OH uchlari ochiladi. Terminal deoksinukleotidil transferaza (TdT) shablonga bog'liq bo'lmagan DNK polimeraza bo'lib, singan DNK molekulalarining 3'-OH uchlariga deoksiribonukleotidlarning kiritilishini katalizlaydi. Shuning uchun TUNEL (TdT vositachiligidagi dUTP Nick End Labeling) hujayra apoptozini aniqlash to'plami kech apoptoz paytida to'qima hujayralarida yadroviy DNKning parchalanishini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin.

Printsip shundaki, TdT fermenti ta'sirida EdUTP (alkin modifikatsiyasi bilan dUTP) genomik DNK parchalanishi paytida ta'sirlangan 3´-OH uchiga qo'shiladi va alkin guruhi azid bo'yog'i bilan halqa hosil qiluvchi reaktsiyada katalizlanadi. bir valentli mis ioni (klik reaktsiyasi) bilan lyuminestsent qismni maqsadli tarzda kiritadi. Ushbu to'plamda iF647 azid ishlatiladi, shuning uchun uni floresan mikroskop yoki oqim sitometriyasi (iF647 qo'zg'alishi 656 nm, emissiya 670 nm) yordamida aniqlash mumkin. Boshqa o'zgartirilgan dUTPlar bilan solishtirganda, EdUTP kichikroq bo'shliqqa qarshilikka ega va TdTase tomonidan DNK uchlariga osonroq biriktiriladi.

Ushbu to'plam keng ko'lamli ilovalarga ega va kerosin to'qimalari bo'limlarida, muzlatilgan to'qimalar bo'limlarida, hujayra skrablarida va hujayra smearlarida apoptozni aniqlash uchun javob beradi.

reaksiyaga bosish belgisini belgilash

 

Shakl 1. Klik kimyosiga asoslangan TUNEL to'plami printsipining sxematik diagrammasi

 

 

Ho'l muz bilan kema; 12 oy davomida -20 darajada saqlang.

 

 

Komponent raqami	Komponent	G1509-50T
G1509-1	Rekombinant Tdt fermenti	50 μL
G1509-2	EdUTP etiketlash aralashmasi	250 μL
G1509-3	Muvozanat buferi	5×1 ml
G1509-4	Proteinaz K (200ug/ml)	1 ml
G1509-5	iF647 azidli bo'yoq	80 μL
G1509-6	Reaktsiya buferi A	5×1 ml
G1509-7	Reaktsiya buferi B	60 μL
G1509-8	Reaktsiya qo'shimchasi (Reagent C)	2 × 100 mg
Qo'llanma		1 dona

 

 

1. PBS fosfat buferi (tavsiya etilgan G0002 yoki G4202);

2. Ruxsat etilgan eritma: PBSda erigan 4% paraformaldegid, pH 7,4 (tavsiya etilgan G1101);

3. Membranani buzuvchi eritma: 0.1% Triton X-100 0.1% natriy sitratida eritilgan (tavsiya etilgan G1204);

4. PBS da tayyorlangan 0.2% Triton X-100; 0.1% Triton X-100 5 mg/ml BSA o'z ichiga olgan PBSda tayyorlangan;

5. Yadroviy bo'yash uchun o'zingizning DAPI (2 µg/ml), Hoechst 33258 yoki PI (1 µg/mL) ni taqdim eting (G1012, G1011, G1021 tavsiya etiladi);

6. Ijobiy nazorat tajribalari uchun DNase I (G3342);

7. Reaktsiya qo'shimchasi (Reagent C) past tezlikda santrifüjlanadi, 100 mg kukun 1 ml o'ta toza suvda (foydalanishga tayyor) eritiladi va 100 mL quyiladi va -20 darajada saqlanadi. zaxira foydalanish uchun qolgan kukun; (Reagent C oksidlanishi oson, havoga uzoq vaqt ta'sir qilmaslikka harakat qiling, suvli eritmaga aylantirilgandan so'ng uni ishlatish uchun kichik qismlarga bo'lish tavsiya etiladi; Reagent C ning suvli eritmasini sinovdan o'tkazgandan so'ng, uning rangi bir oz o'zgarish bo'lsa, reaktsiya tizimi hali ham an'anaviy tarzda amalga oshirilishi mumkin, va agar u jigarrang rangni ko'rsatsa, bu komponentning yaroqsizligini ko'rsatadi)

8. Agar natijaning fon rangi juda qorong'i bo'lsa, bu tajriba davomida etarli darajada yuvish va qoldiq fiksatordan kelib chiqishi mumkin;

9. Reaksiya suyuqligini ketma-ket qo'shishga ehtiyot bo'ling va qo'shayotganda yaxshilab aralashtiring;

10. Salomatligingiz va xavfsizligingiz uchun ish paytida laboratoriya xalati va qo'lqop kiying.

 

 

1. Namuna tayyorlash

A. Parafin o'rnatilgan to'qimalar bo'limlari

a. Parafin to'qimalarining bo'laklari xona haroratida 5-10 daqiqa davomida Ekologik toza dewaxing tiniq eritmasiga (G1128) botirildi va 3 marta takrorlandi; Keyin suvsiz etanolda 5 daqiqa davomida namlang va ikki marta takrorlang; Nihoyat, gradient etanolda (85%, 75% va ikki marta distillangan suv) har birida 5 daqiqa davomida bir marta namlang;

b. Kesmani PBS bilan muloyimlik bilan namlang va namuna atrofidagi ortiqcha suyuqlikni olib tashlang, quyi oqim o'tkazuvchanligini qayta ishlash va muvozanatni belgilash operatsiyalarini osonlashtirish uchun to'qimalarning periferik konturi bo'ylab to'qimalardan 2-3 mm masofada kichik doira chizish uchun PAP qalamini ishlating. tajribalar davomida namunaning qurib ketishiga yo'l qo'ymaslik va namunalarni nam saqlash uchun qayta ishlangan namunalarni nam qutida saqlash;

c. Proteinaz K ishchi eritmasini tayyorlash: Proteinaz K (200 mkg/ml) eritmasini PBS bilan 1:9 nisbatda suyultiruvchi, yakuniy konsentratsiyani 20 mkg/ml hosil qilish uchun suyultiring;

d. Har bir namunaga yuqoridagi Proteinaz K ishchi eritmasidan 100 mkl qo'shing va uni to'liq qoplang va 20 daqiqa davomida 37 daraja inkubatsiya qiling;

Eslatma: Proteinaz K bilan davolash asosan to'qimalar va hujayralarning keyingi bosqichlarida bo'yash reagentlarining o'tishiga hissa qo'shadi va uning inkubatsiya vaqti juda uzoq yoki juda qisqa bo'lib, yaxshi natijalarga erishish uchun keyingi etiketkaning samaradorligiga ta'sir qiladi, inkubatsiya. vaqtni haqiqiy vaziyatga qarab optimallashtirish mumkin.

e. Namunalarni har safar 5 daqiqa davomida PBS eritmasi bilan 3 marta namlash orqali yuving (Proteinaz K toza yuvilishi kerak yoki u keyingi etiketka reaktsiyasiga xalaqit beradi). Namunalarni nam saqlash uchun ishlov berilgan namunalar nam qutiga joylashtirildi;

f. (Ixtiyoriy bosqich) Namunadagi ortiqcha suyuqlikni olib tashlang, to'qimalarga mos miqdorda membranani buzadigan eritma tomchilarini qo'shing, to'qimalarga to'liq infiltratsiya qiling va uni xona haroratida 20 daqiqa davomida davolang; membranani sindirish bilan ishlov berish tugagandan so'ng, namuna PBS eritmasi bilan 3 marta, har safar 5 daqiqa davomida yuviladi; ishlov berilgan namuna namunani nam saqlash uchun nam qutiga joylashtiriladi.

 

B. To'qimalarning muzlatilgan qismi

a. To'qimalarning muzlatilgan qismlari fiksatorga botiriladi va inkubatsiya qilinadi va xona haroratida 10-15 daqiqa davomida mahkamlanadi;

b. To'qimalarining bo'limlari fiksatordan chiqariladi va tabiiy ravishda quritish uchun dudbo'ronga joylashtiriladi;

c. Namunadan qoldiq fiksatorni olib tashlash uchun to'qimalarning qismlari namlanadi va tozalangan suvda yoki PBSda yuviladi;

d. Pastki oqim o'tkazuvchanligini qayta ishlash va muvozanatni belgilash operatsiyalarini osonlashtirish uchun to'qimaning periferik konturi bo'ylab to'qimalardan 2-3 mm masofada kichik doira chizish uchun gistokimyoviy qalamdan foydalaning, tajribalar davomida namunaning qurib ketishiga yo'l qo'ymang va qayta ishlangan mahsulotni saqlang. namunalarni nam saqlash uchun nam qutidagi namunalar;

e. Proteinaz K ishchi eritmasini tayyorlash: Proteinaz K (200 mkg/ml) eritmasini PBS bilan 1:9 nisbatda suyultiruvchi, yakuniy konsentratsiyani 20 mkg/ml hosil qilish uchun suyultiring;

f. Har bir namunaga yuqoridagi Proteinaz K ishchi eritmasidan 100 mkl qo‘shing va u to‘liq qoplanadi va xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi;

Eslatma: Proteinaz K bilan davolash asosan to'qimalar va hujayralarning keyingi bosqichlarida bo'yash reagentlarining o'tishiga hissa qo'shadi va uning inkubatsiya vaqti juda uzoq yoki juda qisqa bo'lib, yaxshi natijalarga erishish uchun keyingi etiketkaning samaradorligiga ta'sir qiladi, inkubatsiya. vaqtni haqiqiy vaziyatga qarab optimallashtirish mumkin.

g. Ortiqcha suyuqlikni olib tashlash uchun namunani PBS eritmasi bilan 2-3 marta yuving (Proteinaz K toza yuvilishi kerak yoki u keyingi etiketka reaktsiyasiga xalaqit beradi) va namunani nam saqlash uchun ishlov berilgan namunani nam qutida saqlang;

h. (Ixtiyoriy bosqich) To'qimalarga mos miqdorda membranani buzuvchi eritma tomchilarini qo'shing, to'qimalarga to'liq infiltratsiya qiling, xona haroratida 20 daqiqa davomida davolang, membranani sindirish bilan ishlov berish namunani PBS eritmasi bilan yuvib bo'lgach, xuddi shunday tugatiladi. ortiqcha suyuqlikni olib tashlash uchun, namunani nam saqlash uchun nam qutidagi namunani davolashdan keyin.

 

C. Hujayralarning o'rmalanishi

a. Yopishqoq hujayralar Lab-Tek slayd kameralarida (Camber Slides) o'stiriladi va slaydlar apoptozni induksion davolashdan so'ng yumshoq namlanadi va PBS bilan 2 marta yuviladi;

b. To'qimalarni qoplash uchun har bir slayd kamerasiga tegishli miqdorda fiksator qo'shiladi va xona haroratida 20 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi;

c. Fiksatorni olib tashlang va har biri 5 daqiqa davomida 3 marta yuvish uchun PBS qo'shing;

d. Har bir namuna PBS da tayyorlangan 0,2% Triton X-100 eritmasiga botiriladi va o'tkazuvchanlik uchun xona haroratida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi;

e. Namunalarni PBS eritmasi solingan ochiq stakanga 2-3 marta botirib yuving;

f. Ortiqcha suyuqlikni muloyimlik bilan olib tashlang va filtr qog'ozidan foydalaning va slayddagi namuna atrofidagi suyuqlikni ehtiyotkorlik bilan quriting. Qayta ishlangan namuna namunani nam saqlash uchun nam qutiga joylashtiriladi.

 

D. Hujayra surtmasi

a. Hujayralar PBSda taxminan 2 × 107 hujayra/ml konsentratsiyada qayta suspenziya qilinadi va 50-100 mL hujayra suspenziyasi ajralishga qarshi slaydga aspiratsiya qilinadi va hujayra suspenziyasini muloyimlik bilan yoyish uchun toza slayddan foydalaniladi;

b. Hujayra smearlari mahkamlash eritmasi bilan to'ldirilgan binoni idishiga botiriladi va hujayralar mahkamlanadi va 25 daqiqa davomida 4 darajaga qoldiriladi;

c. Slaydni PBS ga botiring va ho'llash va chayish uchun uni xona haroratida 5 daqiqaga qoldiring, bir marta takrorlang;

d. Ortiqcha suyuqlikni muloyimlik bilan olib tashlang va filtr qog'ozi bilan slayddagi namuna atrofidagi ortiqcha suyuqlikni ehtiyotkorlik bilan tozalang, quyi oqim o'tkazuvchanligini qayta ishlash va muvozanatni belgilash operatsiyalarini osonlashtirish uchun gistokimyoviy qalam bilan hujayraning periferik konturi bo'ylab kichik doira chizing va ruxsat bermang. namunani tajriba davomida quritish;

e. Har bir namuna PBS da tayyorlangan 0,2% Triton X-100 eritmasiga botiriladi va o'tkazuvchanlik uchun xona haroratida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi;

f. Namunalarni PBS eritmasi solingan ochiq stakanga 2-3 marta botirib yuving.

g. Ortiqcha suyuqlikni muloyimlik bilan olib tashlang va filtr qog'ozi bilan slayddagi namuna atrofidagi suyuqlikni ehtiyotkorlik bilan quriting. Davolangan namunani nam qutiga joylashtirish orqali namunani nam holda saqlang.

 

2. DNaz I bilan davolash ijobiy nazorat tajribasi (ixtiyoriy bosqich)

Namuna o'tkazuvchanligi bilan ishlov berilgandan so'ng, ijobiy nazoratni tayyorlash uchun namunalar DNase I (tavsiya etilgan G3342) bilan ishlov beriladi.

2.1. 100 mkl 1×DNase I buferi (tayyorlash: 10 mkL 10×DNase I buferini oling, so‘ng 90 mkl deionizatsiyalangan suv qo‘shing va yaxshilab aralashtiring) o‘tkazuvchan namunalarga tomchilab qo‘shiladi va xona haroratida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi;

2.2. Ortiqcha suyuqlikni muloyimlik bilan olib tashlang, DNase I (20 U/ml) bo'lgan 100 mkl ishchi eritma qo'shing (tayyorlash usuli: 10 mkl 10 × DNase I buferini oling, so'ngra 2 mL DNase I qo'shing va keyin 88 mkl deionizatsiyalangan eritma qo'shing. aralashtirish uchun suv) va xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qiling;

2.3. Ortiqcha suyuqlikni muloyimlik bilan olib tashlang va slaydlarni PBS bilan to'ldirilgan bo'yash idishida 3-4 marta yaxshilab yuving.

Eslatma: Ijobiy nazorat slaydlarini alohida bo'yash idishi yordamida bo'yash kerak, aks holda musbat nazorat slaydlaridagi qoldiq DNase I eksperimental slaydlarda yuqori fonni keltirib chiqarishi mumkin.

 

3. Belgilash va aniqlash

3.1. Muvozanat: Barcha namuna maydonini qoplash uchun har bir namunaga 50 mkL muvozanat buferini qo'shing va xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qiling;

3.2. Yorliqlash eritmasini tayyorlash: EdUTP yorliqlash aralashmasi va muvozanat buferini muz ustida eriting va Rekombinant TdT fermenti nisbati bo'yicha barcha tajribalar uchun yetarli TdT inkubatsiya buferini aralashtiring: EdUTP etiketlash aralashmasi: muvozanat buferi=1 mkl:5 mkl:50 mkl ( 1:5:50), maxsus tajribalarda ishlatiladigan reagentlar hajmi bo'lishi mumkin slaydlar o'lchamiga ko'ra teng nisbatda sozlangan;

3.3. Salbiy nazorat tizimi: Rekombinant TdT fermentisiz nazorat TdT inkubatsiya buferini tayyorlang va uni ddH2O bilan almashtiring;

3.4. Yorliqlash: imkon qadar ko'proq muvozanat buferini olib tashlang, so'ngra har bir to'qima namunasiga 56 mL TdT inkubatsiya tamponini qo'shing va 37 darajada 1 soat davomida inkubatsiya qiling; slaydlarni quritmaslik uchun ehtiyot bo'ling;

3.5. To'qimalarining namunalarini har biri 5 daqiqadan 4 marta yuvish uchun PBS bilan darhol yuving;

3.6. Reaksiyani bosish: PBS buferini oldingi bosqichdan olib tashlang, namunani yopish uchun 100 mL klik reaktsiyasi eritmasidan tomchilab namunaga qo'shing, xona haroratida yorug'likdan uzoqda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling; (Klik reaktsiyasi tizimi uchun quyidagi jadvalga qarang, har bir reagentni navbatma-navbat qo'shing, qo'shayotganda yaxshilab aralashtiring va preparat miqdori mutanosib ravishda ko'paytirilishi yoki kamayishi mumkin va uni oldindan tayyorlash tavsiya etiladi)

 

Komponent	Ovoz balandligi
Reaktsiya buferi A	925 μL
Reaktsiya buferi B	10 μL
iF647 azidli bo'yoq	15 μL
Reaktsiya qo'shimchasi (Reagent C)	50 μL
Umumiy hajm	1000 μL

 

3.7. Klik reaksiyasi eritmasini olib tashlang va darhol PBS buferi bilan 2-3 marta 5 daqiqa davomida yuving;

3.8. Filtr qog'ozi bilan namuna atrofidagi PBS eritmasini sekin o'chiring;

3.9. Yadroviy bo'yash: Namunalar binoni idishida bo'yaladi, u erda slaydlar DAPI eritmasi (yangi tayyorlangan va PBS bilan suyultirilgan) bo'lgan binoni idishiga zulmatda botiriladi va xona haroratida 8 daqiqaga qoldiriladi (yoki yadroviy bo'yash Hoechst 33258 bilan amalga oshiriladi) );

3.10. Muhrlash: Namunalar bo'yalgandan so'ng, to'qimalar namunalari har safar 5 daqiqa davomida PBS bilan uch marta yuviladi, so'ngra ortiqcha suyuqlik muloyimlik bilan chiqariladi va namunalar floresanga qarshi söndürme muhri tomchilari bilan muhrlanadi (tavsiya etilgan G1401);

3.11. Mikroskop: Namunalarni zudlik bilan lyuminestsent mikroskop ostida tahlil qiling, slaydlar yorug'likdan himoyalangan, DAPI apoptotik va apoptotik bo'lmagan hujayralarni ko'k rangga bo'yadi va faqat apoptotik hujayralar yadrolarida iF647 azid bo'yoq aralashmasi bilan lokalizatsiya qilingan pushti floresans mavjud.

 

Faqat tadqiqot uchun foydalanish uchun!

 

 

Issiq teglar: click-it 647 tunel hujayra apoptozini aniqlash to'plami, Xitoy click-it 647 tunel hujayra apoptozini aniqlash to'plami ishlab chiqaruvchilar, etkazib beruvchilar, zavod