2 × Fast SYBR Green QPCR Master Mix (ROX yoʻq)

 

Mahsulot nomi	Mushuk. Yo'q.	Spesifik.
2× Fast SYBR Green qPCR Master Mix (ROX yo‘q)	G3323-01	1 ml
	G3323-05	5×1 ml
	G3323-15	15×1 ml

 

 

2× Fast SYBR Green qPCR Master Mix (yo‘q ROX) bu SYBR Green I kimerik floresans usuli yordamida qPCR reaktsiyasi uchun maxsus 2× premiks bo‘lib, u primerlar va DNK shablonlaridan tashqari barcha qPCR komponentlarini o‘z ichiga oladi, bu operatsiya bosqichlarini qisqartirishi va vaqtni qisqartirishi mumkin. namunalarni qo'shish va ifloslanish ehtimolini kamaytirish. Asosiy komponent genetik jihatdan yaratilgan issiq ishga tushiriladigan Taq DNK polimeraza bo'lib, u DNK polimeraza faolligini samarali tarzda to'xtatadi va monoklonal antikor va Taq DNK polimerazasini samarali birlashtirib, past haroratlarda o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishining oldini oladi, yuqori o'ziga xoslik va yuqori sezuvchanlik kabi ko'plab afzalliklarga ega. va qPCR uchun optimallashtirilgan reaksiya buferi bilan birlashtirilgan. Bu yuqori o'ziga xoslik va yuqori sezuvchanlik qPCR reaktsiyasi uchun juda mos keladi. Ushbu mahsulot qPCR reaktsiyasi uchun SYBR Green I ning optimal kontsentratsiyasini o'z ichiga olgan 2 × oldindan aralashtirilgan reagent bo'lib, u keng miqdoriy mintaqada yaxshi standart egri chiziqni, maqsadli genlarning aniq miqdorini, yaxshi takrorlanishi, yuqori ishonchliligi va eng tez qPCR reaktsiyasini olishi mumkin. 30 daqiqada bajarilishi mumkin.

 

 

Ho'l muz bilan yuboring. -20 darajada yorugʻliksiz saqlang, amal qilish muddati 12 oy. Muzlatish-eritish davrlaridan saqlaning. Eritgandan so'ng, u yorug'liksiz bir oy davomida 4 daraja haroratda barqaror saqlanishi mumkin.

 

 

Komponent	G3323-01	G3323-05	G3323-15
2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix (ROX yoʻq)	1 ml	5×1 ml	15×1 ml
Qo'llanma	Bitta nusxa

 

 

Boshlashdan oldin

1. Real Time PCR kuchaytiruvchi asbob;

2. Tajriba uchun maxsus reaksiya trubkasi yoki reaksiya plitasi;

3. PCR primerlari (mos yozuvlar primerini loyihalash tamoyillari);

4. Mikropipetka va avtoklavlash uchlari;

 

 

1.QPCR reaktsiya tizimini tavsiya eting:

Komponent	20 mkl rxn	50 mkl rxn	Yakuniy konsentratsiya
2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix (ROX yoʻq)	10 μL	25 μL	1×
Oldinga primer (10 mkM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Teskari astar (10 mkM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Andoza	O'zgaruvchan	O'zgaruvchan	talab qilinganidek
Nukleazsiz suv	20 mkl qo'shing	50 mL qo'shing

 

a. Odatda, {0}},2 mkM yakuniy konsentratsiyasi bilan yaxshi kuchaytirish effektini olish mumkin. Reaktsiya unumdorligi yomon bo'lsa, primer konsentratsiyasini 0.2-1,0 mkM oralig'ida sozlash mumkin.

b. Qo'shilgan shablon miqdori maqsadli genning nusxalari soniga qarab o'zgaradi va shablonni qo'shishning tegishli miqdori gradient suyultirish orqali o'rganiladi. 20 mL reaktsiya tizimida shablon DNKning eng yaxshi qo'shilgan miqdori 100 ng dan kam edi. RT-PCR reaktsiyasining cDNK (RT reaksiya eritmasi) shablon sifatida ishlatilganda, qo'shilish miqdori yakuniy qPCR hajmining 10% dan oshmasligi kerak.

1. PCR reaktsiyasi protsedurasi (asboblarga ko'ra sozlanishi mumkin):

Bosqich	Qadam	Tsikllar soni	Harorat	Vaqt
1-bosqich	Predegeneratsiya	1	95 daraja	30 soniya
2-bosqich	Degeneratsiya	40	95 daraja	3-10 soniya
	tavlanish - kengaytma		60 daraja	10-30 soniya
3-bosqich	erish egri chizig'i	1	Asbobning standart sozlamalari

Tegishli markadagi lyuminestsent miqdoriy PCR asbobining tezkor usulidan foydalanish tavsiya etiladi va u standart kuchaytirish protsedurasiga mos keladi. Tezkor protsedura ko'pchilik genlar uchun mos keladi va standart protsedura murakkab ikkilamchi tuzilishga ega bo'lgan ba'zi genlar uchun sinab ko'rish mumkin.

a: genom shabloni degeneratsiyadan oldingi vaqtni 2-3 daqiqaga uzaytirishi mumkin;

b: sikl bosqichi: standart protseduraning denaturatsiya vaqti 10 sek. Agar kuchaytirilgan fragment 200 bp dan kam bo'lsa, tezkor protsedura uchun eng qisqa variant 3 soniya.

c: sikl bosqichi: standart protsedura tavlanish/uzayish vaqti 30 sek uchun tanlanadi; Agar kuchaytirilgan fragment 200 bp dan kam bo'lsa, eng qisqa protsedura 10 soniya sifatida tanlanishi mumkin. 200 bp dan ortiq, tavsiya etilgan tanlov 30 sek; Floresan signalini yig'ish uchun asbobning yo'riqnomasiga muvofiq eksperimental protsedurani o'rnating.

 

 

1. Ishlatishdan oldin sekin teskari aralashtiriladi. Pufakchalar paydo bo'lmasligi uchun aylantirmang va silkitmang. Ishlatishdan oldin reagentlarni yaxshilab aralashtiring.

2. Reaksiya eritmasini tayyorlashda reaktivlarni muz ustiga qo'yish kerak.

3. Mahsulot SYBR Green floresan bo'yog'ini o'z ichiga oladi, shuning uchun PCR reaktsiyasi eritmasini tayyorlashda kuchli yorug'likdan qochish kerak.

4. Iltimos, namunalar orasidagi ifloslanishni oldini olish uchun reaksiya eritmasini tayyorlash va qadoqlash uchun yangi bir martalik boshdan foydalaning.

5. Master Mixni qayta-qayta muzdan tushirishdan saqlaning va uni eritgandan keyin bir oy ichida ishlatishga harakat qiling.

 

 

PCR mashinasining markasi	G3323 (ROX yo'q)	G3324 (Past ROX)	G3325 (Yuqori ROX)
ABI Thermo hayoti	PikoRealTM Cycler	7500/7500 Tez, ViiA 7™ QuantStudio™ seriyasi	5700/7000/7300/7700/7900/ 7900HT/7900 HT Fast,StepOne™,StepOne Plus™
Stratgen		Mx3000P®/3005P™/4000™
Bio-Rad	Barcha seriyalar
Ependorf	Realplex 2s, Mastercycler®ep realplex
IIIumina	Ekologik QPCR
Sefeid	SmartCycler®
Qiagen Korbett	Rotor-Gene® seriyasi
Roche	LightCycler™ seriyasi
Takara	Thermal Cycler Dice seriyasi
Analitik	qTOWER seriyali
qTOWER	LineGene seriyasi

 

 

1. Kuchaytirish mahsulotining uzunligi 80-300 bp orasida bo'lishi tavsiya etiladi;

2. Astar uzunligi: 18-25 bp;

3. Primerlarda G+C asosining tarkibi 40%-60% orasida bo'lishi kerak;

4. Oldinga va teskari primerlar orasidagi Tm qiymati farqi 2 darajadan kam va 58-62 daraja orasidagi Tm qiymati eng yaxshisi;

5. Baza taqsimotining tasodifiyligi;

6. Primerlar o'z-o'zini to'ldiruvchi ketma-ketliklarni o'z ichiga olmaydi, aks holda ular ikkilamchi soch turmagini hosil qiladi;

7. Ikki primer o'rtasida 4 tadan ko'p bo'lmagan bir-birini to'ldiruvchi yoki gomologik asoslar bo'lishi kerak, aks holda primer dimer hosil bo'ladi, ayniqsa 3' uchida to'ldiruvchi qoplama;

8. Primerning 3' terminal asosi G yoki C bo'lishi tavsiya etiladi;

9. NCBI solishtirish natijalarida o'ziga xos bo'lmagan boshqa mahsulotlar topilmadi.

 

 

Muammo tavsifi	Mumkin sabablar	Yechimlar
Reaksiya oxirida hech qanday kuchaytirish egri chizig'i paydo bo'lmadi yoki CT qiymati juda kech paydo bo'ldi	Shablon konsentratsiyasi juda past	Shablonni suyultirishni bir necha marta kamaytirish uchun tajribani takrorlang va namuna konsentratsiyasi noma'lum bo'lganda eng yuqori konsentratsiyadan boshlang
	Shablon degradatsiyasi	Shablon yana tayyorlandi va tajriba takrorlandi
	Tizimda PCR inhibitörleri mavjud	Odatda, shablon o'tkaziladi, shablonni suyultirish nisbati oshiriladi yoki yuqori tozalikdagi shablon qayta tayyorlanadi va takrorlanadi.
	Primerlar yomonlashishi mumkin	Uzoq vaqt davomida ishlatilmagan primerlar degradatsiya ehtimolini istisno qilish uchun avval PAGE elektroforezi orqali yaxlitlik uchun sinovdan o'tkazilishi kerak.
	Kuchaytirishning past samaradorligi	Primer konsentratsiyasini oshiring, uch bosqichli kuchaytirish protsedurasini sinab ko'ring yoki primerni qayta loyihalashtiring
	Kuchaytirish mahsuloti juda uzun	Kuchaytirish mahsulotining uzunligi 80-300 bp oralig'ida nazorat qilindi
Bo'sh boshqaruv signalni ko'rsatadi	Reaktsiya tizimining ifloslanishi	Birinchidan, bo'sh nazorat suvini almashtirish kerak. Agar xuddi shunday holat davom etsa, primerlar, aspiratorlar va PCR naychalarini almashtirish yoki yangi Master Mixni boshlash kerak. Reaksiya tizimi aerozol ifloslanishini kamaytirish uchun super toza stolda tayyorlanadi
	Primer dimerlar kabi o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish paydo bo'ladi	Odatda, kuchaytiruvchi mahsulotlar 35 tsikldan so'ng bo'sh nazoratda paydo bo'lishi odatiy holdir, ular erish egri chizig'i bilan tahlil qilinishi kerak. Primerni qayta loyihalash, primer konsentratsiyasini sozlash yoki PCR reaksiya jarayonini optimallashtirish
Erish egri chizig'i bir nechta cho'qqilarga ega	Primer dizayni yomon	Yangi primer astar dizayni tamoyillariga muvofiq qayta ishlab chiqilgan
	Primer konsentratsiyasi juda yuqori	Primer konsentratsiyasini mos ravishda kamaytiring
	cDNK shablonida genomik ifloslanish mavjud	Olingan RNK eritmasi genomik ifloslanishni olib tashlash yoki transintron primerlarini loyihalash uchun dsDNase kabi DNK fermentlari yordamida hazm qilinadi.
Tajribalarning yomon takrorlanishi	Namuna qo'shish xatosi katta	Yuqori sifatli assimilyatsiya boshi aniq pipetka bilan aniq pipetkadan foydalanish; Namuna olish xatosini kamaytirish uchun katta hajmli shablonni qo'shib, yuqori suyultirish shabloni; qPCR ning reaksiya hajmi kengaytirildi
	Shablon konsentratsiyasi juda past	Shablonni suyultirish vaqtini kamaytirish uchun tajribani takrorlang
	qPCR asbobining turli joylarida haroratning og'ishi	qPCR asbobini muntazam ravishda kalibrlang
Kuchaytirish egri chizig'i silliq emas	Floresan signali juda zaif, tizim tuzatishdan so'ng hosil bo'ladi	Master Mixda oldindan aralashtirilgan bo'yoqlar buzilmasligiga ishonch hosil qiling; Yaxshiroq qPCR sarf materiallarini yig'ish uchun floresan signalni almashtiring
Amplifikatsiya egri chizig'i buziladi yoki siljiydi	Shablon kontsentratsiyasi yuqoriroq va asosiy yakuniy nuqta qiymati CT qiymatidan kattaroq edi	Asosiy yakuniy nuqta (Ct qiymati -3) qisqartirildi va ma'lumotlar qayta tahlil qilindi
Alohida quduqlarning kuchayish egri chiziqlari birdan keskin pasayib ketdi	Reaksiya trubkasida pufakchalar mavjud	MIX to'liq eriganligiga ishonch hosil qiling va bir tekis aylanmasligi va tebranmasligiga ishonch hosil qiling; Namuna qo'shilgandan so'ng, pufakchalar engil elastik bilan santrifüjlash orqali chiqariladi. Pufakchalarni olib tashlash uchun denaturatsiyadan oldingi vaqt 10 minutgacha uzaytirildi

 

Faqat tadqiqot uchun foydalanish uchun!

 

 

Issiq teglar: 2 × fast sybr green qpcr master mix (none rox), Xitoy 2 × fast sybr green qpcr master mix (none rox) ishlab chiqaruvchilar, etkazib beruvchilar, zavod