Mahsulot taqdimoti
|
Mahsulot nomi |
Mushuk. Yo'q. |
Spesifik. |
|
2×SYBR Green qPCR Master Mix (past ROX) |
G3321-01 |
1 ml |
|
G3321-05 |
5×1 ml |
|
|
G3321-15 |
15×1 ml |
Mahsulot tavsifi/kirish
Ushbu mahsulot SYBR Green I kimerik floresan usuli yordamida qPCR reaktsiyasi uchun maxsus 2 × oldindan aralashtirilgan eritmadir. U primerlar va DNK shablonlaridan tashqari barcha qPCR komponentlarini o'z ichiga oladi, ular operatsiya bosqichlarini qisqartirishi, namuna qo'shish vaqtini qisqartirishi va ifloslanish ehtimolini kamaytirishi mumkin. Asosiy komponent genetik jihatdan ishlab chiqilgan issiqlik bilan faollashtirilgan Taq DNK polimeraza bo'lib, u DNK polimeraza faolligini samarali bloklaydi va monoklonal antikorlarni Taq DNK polimeraza bilan samarali bog'lash orqali past haroratlarda nonspesifik kuchaytirilishining oldini oladi. Issiqlik bilan faollashtirilgan Taq DNK polimeraza yuqori o'ziga xoslik va aniqlash sezgirligi kabi ko'plab afzalliklarga ega. qPCR uchun optimallashtirilgan reaksiya buferi bilan u yuqori o'ziga xoslik va yuqori sezuvchanlik qPCR reaktsiyalari uchun juda mos keladi. Ushbu mahsulot qPCR reaktsiyasi uchun SYBR Green I ning optimal konsentratsiyasini o'z ichiga olgan 2 × oldindan aralashtirilgan reagent bo'lib, keng miqdoriy maydonda yaxshi standart egri chiziqni olishi mumkin. Maqsadli genlarning miqdori aniq, takrorlanadigan va ishonchli.
Saqlash va foydalanish shartlari
Nam muz bilan tashish. -20 darajada yorugʻliksiz saqlang, amal qilish muddati 12 oy. Muzlatish/eritish siklidan saqlaning. Eritgandan so'ng, u yorug'liksiz bir oy davomida 4 daraja haroratda barqaror saqlanishi mumkin.
Komponent
|
Komponent |
G3320-01 |
G3320-05 |
G3320-15 |
|
2×SYBR Green qPCR Master Mix (past ROX) |
1 ml |
5×1 ml |
15×1 ml |
|
Qo'llanma |
Bitta nusxa |
||
Tahlil protokoli / protseduralari
Tajribadan oldin tayyorgarlik
1. Real Time PCR kuchaytirish apparati;
2. Tajriba uchun maxsus reaksiya trubkasi yoki reaksiya plitasi;
3. PCR primerlari (mos yozuvlar primerini loyihalash tamoyillari);
4. Mikropipetka va pipetka boshi (avtoklavlash);
Protseduralar
1. qPCR reaktsiya tizimini tavsiya eting:
|
Komponent |
20 mkl rxn |
50 mkl rxn |
Yakuniy konsentratsiya |
|
2×SYBR Green qPCR Master Mix (past ROX) |
10 μL |
25 μL |
1× |
|
Oldinga primer (10 mkM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
|
Teskari astar (10 mkM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
|
Andoza |
Oʻzgaruvchan |
Oʻzgaruvchan |
talab qilinganidek |
|
Nukleazsiz suv |
20 mkl qo'shing |
50 mL qo'shing |
a. Odatda, {0}},2 mkM yakuniy konsentratsiyasi bilan yaxshi kuchaytirish effektini olish mumkin. Reaktsiya unumdorligi yomon bo'lsa, primer konsentratsiyasini 0.2-1,0 mkM oralig'ida sozlash mumkin.
b. Shablonni qo'shish miqdori shablon eritmasidagi maqsadli genning nusxasi soniga qarab o'zgaradi va shablonni qo'shishning tegishli miqdori gradient suyultirish orqali muhokama qilinadi. 20 mL reaktsiya tizimida shablon DNKning eng yaxshi qo'shilgan miqdori 100 ng dan kam edi. RT-PCR reaktsiyasining cDNK (RT reaksiya eritmasi) shablon sifatida ishlatilganda, qo'shilgan miqdor PCR reaktsiyasi eritmasining umumiy hajmining 10% dan oshmasligi kerak.
2. PCR reaktsiyasi protsedurasi (asboblarga ko'ra sozlanishi mumkin):
|
A. Ikki bosqichli usul * |
B. Uch bosqichli usul * |
||||||||
|
Bosqich |
Qadam |
Velosipedlar |
Harorat |
Vaqt |
Bosqich |
Qadam |
Velosipedlar |
Harorat |
Vaqt |
|
1-bosqich |
Predegeneratsiya |
1 |
95 daraja |
30 sek |
1-bosqich |
Predegeneratsiya |
1 |
95 daraja |
30 sek |
|
2-bosqich |
Degeneratsiya |
40 |
95 daraja |
15 sek |
2-bosqich |
Degeneratsiya |
40 |
95 daraja |
15 sek |
|
Yuvish - kengaytirish |
60 daraja |
30 soniya |
Yuvish |
55-65 daraja |
10 sek |
||||
|
Kengaytma |
72 daraja |
30 soniya |
|||||||
|
3-bosqich |
Erish egri chizig'i |
1 |
Asbobning standart sozlamalari |
3-bosqich |
Erish egri chizig'i |
1 |
Asbobning standart sozlamalari |
||
*: Agar kuchaytirish o'ziga xosligini yaxshilash kerak bo'lsa, ikki bosqichli protsedura yoki tavlanish harorati ishlatilishi mumkin; Kuchaytirish samaradorligini oshirish uchun uch bosqichli protsedura yoki uzaytirish vaqtidan foydalanish mumkin.
a: Flüoresan signalni yig'ish uchun asbobning yo'riqnomasiga muvofiq eksperimental jarayonni o'rnating.
Eslatma
1. Ishlatishdan oldin sekin teskari aralashtiriladi. Pufakchalar paydo bo'lmasligi uchun aylantirmang va silkitmang. Ishlatishdan oldin reagentlarni yaxshilab aralashtiring.
2. Reaksiya eritmasini tayyorlashda reaktivlarni muz ustiga qo'yish kerak.
3. Mahsulot SYBR Green floresan bo'yog'ini o'z ichiga oladi, shuning uchun PCR reaktsiyasi eritmasini tayyorlashda kuchli yorug'likdan qochish kerak.
4. Iltimos, namunalar orasidagi ifloslanishni oldini olish uchun reaksiya eritmasini tayyorlash va qadoqlash uchun yangi bir martalik boshdan foydalaning.
5. Master Mixni qayta-qayta muzdan tushirishdan saqlaning va uni eritgandan keyin bir oy ichida ishlatishga harakat qiling.
Moslik
|
PCR mashinasining markasi |
G3320 (ROX yo'q) |
G3321 (Past ROX) |
G3322 (Yuqori ROX) |
|
ABI Thermo hayoti |
PikoRealTM Cycler |
7500/7500 Tez, ViiA 7™ QuantStudio™ seriyasi |
5700/7000/7300/7700/7900/ 7900HT/7900 HT Fast,StepOne™,StepOne Plus™ |
|
Stratgen |
Mx3000P®/3005P™/4000™ |
||
|
Bio-Rad |
Barcha seriyalar |
||
|
Ependorf |
Realplex 2s, Mastercycler®ep realplex |
||
|
IIIumina |
Ekologik QPCR |
||
|
Sefeid |
SmartCycler® |
||
|
Qiagen Korbett |
Rotor-Gene® seriyasi |
||
|
Roche |
LightCycler™ seriyasi |
||
|
Takara |
Thermal Cycler Dice seriyasi |
||
|
Analitik |
qTOWER seriyali |
||
|
qTOWER |
LineGene seriyasi |
Primerni loyihalash tamoyillari
1. Kuchaytirish mahsulotining uzunligi 80-300 bp orasida bo'lishi tavsiya etiladi;
2. Astar uzunligi: 18-25 bp;
3. Primerlarda G+C asosining tarkibi 40%-60% orasida bo'lishi kerak;
4. Oldinga va teskari primerlar orasidagi Tm qiymati farqi 2 darajadan kam va 58-62 daraja orasidagi Tm qiymati eng yaxshisi;
5. Baza taqsimotining tasodifiyligi;
6. Primerlar o'z-o'zini to'ldiruvchi ketma-ketliklarni o'z ichiga olmaydi, aks holda ular ikkilamchi soch turmagini hosil qiladi;
7. Ikki primer o'rtasida 4 tadan ko'p bo'lmagan bir-birini to'ldiruvchi yoki gomologik asoslar bo'lishi kerak, aks holda primer dimer hosil bo'ladi, ayniqsa 3' uchida to'ldiruvchi qoplama;
8. Primerning 3' terminal asosi G yoki C bo'lishi tavsiya etiladi;
9. NCBI solishtirish natijalarida o'ziga xos bo'lmagan boshqa mahsulotlar topilmadi.
Muammolarni bartaraf qilish; nosozliklarni TUZATISH
|
Muammo tavsifi |
Mumkin sabablar |
Yechimlar |
|
Reaksiya oxirida hech qanday kuchaytirish egri chizig'i paydo bo'lmadi yoki CT qiymati juda kech paydo bo'ldi |
Shablon konsentratsiyasi juda past |
Shablonni suyultirishni bir necha marta kamaytirish uchun tajribani takrorlang va namuna konsentratsiyasi noma'lum bo'lganda eng yuqori konsentratsiyadan boshlang |
|
Shablon degradatsiyasi |
Shablon yana tayyorlandi va tajriba takrorlandi |
|
|
Tizimda PCR inhibitörleri mavjud |
Odatda, shablon o'tkaziladi, shablonni suyultirish nisbati oshiriladi yoki yuqori tozalikdagi shablon qayta tayyorlanadi va takrorlanadi. |
|
|
Primerlar yomonlashishi mumkin |
Uzoq vaqt davomida ishlatilmagan primerlar degradatsiya ehtimolini istisno qilish uchun avval PAGE elektroforezi orqali yaxlitlik uchun sinovdan o'tkazilishi kerak. |
|
|
Kuchaytirishning past samaradorligi |
Primer konsentratsiyasini oshiring, uch bosqichli kuchaytirish protsedurasini sinab ko'ring yoki primerni qayta loyihalashtiring |
|
|
Kuchaytirish mahsuloti juda uzun |
Kuchaytirish mahsulotining uzunligi 80-300 bp oralig'ida nazorat qilindi |
|
|
Bo'sh boshqaruv signalni ko'rsatadi |
Reaktsiya tizimining ifloslanishi |
Birinchidan, bo'sh nazorat suvini almashtirish kerak. Agar xuddi shunday holat davom etsa, primerlar, aspiratorlar va PCR naychalarini almashtirish yoki yangi Master Mixni boshlash kerak. Reaksiya tizimi aerozol ifloslanishini kamaytirish uchun super toza stolda tayyorlanadi |
|
Primer dimerlar kabi o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish paydo bo'ladi |
Odatda, kuchaytiruvchi mahsulotlar 35 tsikldan so'ng bo'sh nazoratda paydo bo'lishi odatiy holdir, ular erish egri chizig'i bilan tahlil qilinishi kerak. Primerni qayta loyihalash, primer konsentratsiyasini sozlash yoki PCR reaksiya jarayonini optimallashtirish |
|
|
Erish egri chizig'i bir nechta cho'qqilarga ega |
Primer dizayni yomon |
Yangi primer astar dizayni tamoyillariga muvofiq qayta ishlab chiqilgan |
|
Primer konsentratsiyasi juda yuqori |
Primer konsentratsiyasini mos ravishda kamaytiring |
|
|
cDNK shablonida genomik ifloslanish mavjud |
Olingan RNK eritmasi genomik ifloslanishni olib tashlash yoki transintron primerlarini loyihalash uchun dsDNase kabi DNK fermentlari yordamida hazm qilinadi. |
|
|
Tajribalarning yomon takrorlanishi |
Namuna qo'shish xatosi katta |
Yuqori sifatli assimilyatsiya boshi aniq pipetka bilan aniq pipetkadan foydalanish; Namuna olish xatosini kamaytirish uchun katta hajmli shablonni qo'shib, yuqori suyultirish shabloni; qPCR ning reaksiya hajmi kengaytirildi |
|
Shablon konsentratsiyasi juda past |
Shablonni suyultirish vaqtini kamaytirish uchun tajribani takrorlang |
|
|
qPCR asbobining turli joylarida haroratning og'ishi |
qPCR asbobini muntazam ravishda kalibrlang |
|
|
Kuchaytirish egri chizig'i silliq emas |
Floresan signali juda zaif, tizim tuzatishdan so'ng hosil bo'ladi |
Master Mixda oldindan aralashtirilgan bo'yoqlar buzilmasligiga ishonch hosil qiling; Yaxshiroq qPCR sarf materiallarini yig'ish uchun floresan signalni almashtiring |
|
Amplifikatsiya egri chizig'i buziladi yoki siljiydi |
Shablon kontsentratsiyasi yuqoriroq va asosiy yakuniy nuqta qiymati CT qiymatidan kattaroq edi |
Asosiy yakuniy nuqta (Ct qiymati -3) qisqartirildi va ma'lumotlar qayta tahlil qilindi |
|
Alohida quduqlarning kuchayish egri chiziqlari birdan keskin pasayib ketdi |
Reaksiya trubkasida pufakchalar mavjud |
MIX to'liq eriganligiga ishonch hosil qiling va bir tekis aylanmasligi va tebranmasligiga ishonch hosil qiling; Namuna qo'shilgandan so'ng, pufakchalar engil elastik bilan santrifüjlash orqali chiqariladi. Pufakchalarni olib tashlash uchun denaturatsiyadan oldingi vaqt 10 minutgacha uzaytirildi |
Faqat tadqiqot uchun foydalanish uchun!
Issiq teglar: 2×sybr green qpcr master mix (past rox), Xitoy 2×sybr green qpcr master mix (past rox) ishlab chiqaruvchilar, yetkazib beruvchilar, zavod
